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PCR反应引物设计基础
日期：2025-05-03 01:56
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摘要：
PCR反应引物设计基础:（99%的问题可以解决）
1.引物长度：教科书要求15-30bp，常用为20bp左右。实际情况zui好是18-24bp，以保证特异性，不是越长越好，太长的引物同样会降低特异性，并且降低产量 。
2.引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGCzui好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性，避免3'端GC rich， zui后3个...
PCR反应引物设计基础:（99%的问题可以解决）
1.引物长度：教科书要求15-30bp，常用为20bp左右。实际情况zui好是18-24bp，以保证特异性，不是越长越好，太长的引物同样会降低特异性，并且降低产量 。
2.引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGCzui好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性，避免3'端GC rich， zui后3个碱基不要有GC，或者zui后5个有3个不要是GC。
4.避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
5.引物3’端的碱基，特别是zui末及倒数第2个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6.引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列zui好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
7.引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
8.学会使用软件：PP5，Oligo6，DNAstar，Vector NTI，primer3（这个在线设计zui好用）。
以上内容，至少可以解决99%的引物设计问题。