产品名称：PKBα人蛋白激酶BαELISA试剂盒说明书

试剂和样本的控制方法：
一、试剂
1.试剂的选择：国家明确要求要采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关，我司严格按照国家标准进行生产，已获得国家承认的“三证”，每一个产品都有对应的生产批号，只要客户提前下单，我们就能为您提供新批次的产品，不必担心会有过期的试剂。我司的试剂，值得您选择。
2.试剂的准备：先将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20-30 min后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。
二、样本
1.内源性干扰因素：包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等；
类风湿因子的控制方法：
①用F(ab)2替代完整的IgG；
②标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理；
③检测抗原时，可用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解。

下列是公司产品ELISA试剂盒的详细说明书：
中文名称：PKBα人蛋白激酶BαELISA试剂盒说明书
英文简称：Human Protein Kinase B Alpha(PKBa)ELISA Kit
产品货号：PH102404
规格：96T/48T
适用范围：仅供科研使用
保存及有效期：2-8℃保存，6个月，-20℃一年

使用方法：
测定法的灵敏度来自作为报告的酶。众所周知，酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。   24μg/ml    5号标准品    150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
 12μg/ml    4号标准品    150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
 6μg/ml     3号标准品    150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
 3μg/ml     2号标准品    150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
 1.5μg/ml   1号标准品    150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。|
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   
4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
ELISA 试验时，注意事项如下： 
     1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 
     2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括: 
     （1） 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。 
     （2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的zui适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg／ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值zui大而蛋白量zui少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。 
     （3） 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。 
     （4） 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要**价廉、**、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入 。

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PKBα人蛋白激酶BαELISA试剂盒说明书检测程序：
1.  加样：每孔各加入标准品或待测样品 100ul ，将反应板充分混匀后置 37 ℃ 120 分钟。
2.  洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次，向滤纸上印干。
3.  每孔中加入抗体工作液10 0ul 。将反应板充分混匀后置 37 ℃ 6 0 分钟。
4.  洗板：同前。
5.  每孔加酶标抗体工作液100ul 。将反应板置 37 ℃ 3 0 分钟。
6.  洗板：同前。
7.  每孔加入底物工作液100ul ，置 37   ℃ 暗处反应15 分钟。
8.  每孔加入100ul 终止液混匀。
9.  30分钟内用酶标仪在 45 0 nm 处测 吸光值。