咨询电话：18117197628
商品货号
PR5737
英文名称
Dengue Virus(DENV
商品名称
登革病毒2型
产品分类
荧光定量PCR
规格
50T
包装
盒装
用途
仅供科研研究实验
保存
-20℃避光
PCR试剂盒实验步骤：
准备阶段：
登革病毒2型探针法荧光定量RT-PCR在PCR管上做好标记，并将其置于冰上或低温金属块上。
按照所使用的PCR酶说明书上的体系配制反应预混液。这是一种具有高特异性及优良扩增性的高保真DNA聚合酶，适用于简单或复杂模板、短片段或长片段的PCR扩增，并添加了单克隆抗体以在常温条件下抑制DNA polymerase活性，允许在常温下配制预混液。
配制反应液时，按照顺序添加RNase free water、10×PCR Buffer、dNTP Mix、引物，后加入DNA聚合酶。注意模板需在模板区加入。
预变性处理：
将待检测的DNA样品与缓冲液混合，加入引物和dNTPs，然后在适当的温度下进行预变性处理，使DNA双链解开。
PCR循环：
加入DNA聚合酶和荧光染料，在变性、复性、延伸的温度循环中完成DNA的扩增。
通过荧光信号的读取和分析，得出待检测DNA样品的浓度和序列信息。
结果分析：
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高分辨率等优点，能够检测出微量的DNA，并准确地检测出DNA序列的变异和突变。
结果分析方法包括定量和相对定量，根据实验需求选择合适的方法进行分析。
整个实验过程中，需要注意试剂的配制顺序、酶的使用条件、模板的添加量以及引物的浓度，以确保实验的准确性和可重复性。此外，实验设计阶段需要充分考虑实验原理、操作流程、设备和试剂的选择，以及实验记录的详细性，这些都是保证实验成功和结果可靠的关键因素。
实验流程：
1. 配制PCR反应体系：
- 模板DNA：10-100 ng（取决于模板的复杂性和丰度）
- 引物F（正向）：0.1-1.0 μM
- 引物R（反向）：0.1-1.0 μM
- dNTPs（混合的dATP、dCTP、dGTP、dTTP）：0.2 mM each
- 10×PCR缓冲液：1×
- MgCl2：1.5-2.5 mM（根据酶的要求调整）
- DNA聚合酶：0.5-2.5 U（根据酶的活性调整）
- 无菌去离子水：补足至总体积（通常为20-50 μL）
2. 设置PCR程序：
- 初始变性：95°C，3-5分钟（激活聚合酶）
- 变性：95°C，15-30秒（每个循环）
- 退火：50-65°C，15-30秒（根据引物Tm调整）
- 延伸：72°C，30-60秒/kb（根据目标片段长度调整）
- 终延伸：72°C，5-10分钟
- 保存：4°C
3. 执行PCR：
- 将配制好的反应体系放入PCR仪器中，启动程序。
4. 电泳分析：
- PCR结束后，取少量反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳，以验证扩增效果。
5. 结果判断：
- 观察电泳结果，目标条带应清晰可见，无非特异性扩增。
PCR操作流程及注意事项：
一、试剂准备阶段
试剂准备是 PCR 操作的个流程，需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。所有的 PCR 体系都应该在 - 20℃ 保存，除了 ddH2O 之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。体系配制完成之后应马上进行 PCR 反应。
二、样本制备阶段
样本制备是整个 PCR 反应中为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的性。严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。所有操作需要在生物柜内进行，操作前后生物柜需要进行紫外灯，注意生物柜中物品的排放。戴手套并勤于更换，要有「无核酸观念」 。
三、核酸扩增
在核酸扩增环节需要选择质量好的 Ep 管，装入反应体系的 EP 管上机前混匀、离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。同时严密检测 PCR 扩增仪的各项性能指标，其中对 PCR 扩增仪而言温度控制就意味着质量。
四、产物分析
常见问题：
1）无 CT 值出现：模板量不足（杂质的引入及反复冻融的情况等）
2）CT 值出现过晚（大于 38）：各种反应成分的降解或加样量的不足
3）标准曲线线性相关性不佳：加样误差、标准品出现降解等
4）阴性对照有信号：模板有基因组的污染
5）扩增效率低：反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应抑制
6）扩增曲线的异常：模板的浓度太高或荧光染料的降解
公司正在出售的产品：
|
人类缺陷病毒1型（HIV-1）PCR检测试剂盒（荧光PCR法）
Grass carp reovirus(GCRV
鲤春病毒血症病毒PCR检测试剂盒
Coxiella burnetii
猪葡萄球菌PCR检测试剂盒
Arachnia propionica
无乳链球菌PCR检测试剂盒
Bonamia ostreae
血红链球菌PCR检测试剂盒
Wuchereria bancrofti
马类圆线虫PCR检测试剂盒
Pasteurella spp
猪痘病毒PCR检测试剂盒
Meta
福赛斯坦纳菌PCR检测试剂盒
BK病毒(BK Virus、BKV
马泰勒梨形虫PCR检测试剂盒
Mycobacterium microti
蜱传出血热病毒PCR检测试剂盒
Leucocytozoon caulleryi
布氏旋毛虫PCR检测试剂盒
Singapore Grouper Iridovirus(SGIV
滴虫通用PCR检测试剂盒
Sinorhizobium spp
微细毛圆线虫PCR检测试剂盒
登革病毒2型探针法荧光定量RT-PCRTrichophyton mentagrophytes
布氏布氏锥虫PCR检测试剂盒
Bovine Parvovirus (BP）V
火鸡星状病毒PCR检测试剂盒
Subulura brumpti
|