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商品货号
PR6161
英文名称
Pythium insidiosum
商品名称
隐袭腐霉
产品分类
荧光定量PCR
规格
50T
包装
盒装
用途
仅供科研研究实验
保存
-20℃避光
PCR试剂盒实验步骤：
准备阶段：
隐袭腐霉探针法荧光定量PCR在PCR管上做好标记，并将其置于冰上或低温金属块上。
按照所使用的PCR酶说明书上的体系配制反应预混液。这是一种具有高特异性及优良扩增性的高保真DNA聚合酶，适用于简单或复杂模板、短片段或长片段的PCR扩增，并添加了单克隆抗体以在常温条件下抑制DNA polymerase活性，允许在常温下配制预混液。
配制反应液时，按照顺序添加RNase free water、10×PCR Buffer、dNTP Mix、引物，后加入DNA聚合酶。注意模板需在模板区加入。
预变性处理：
将待检测的DNA样品与缓冲液混合，加入引物和dNTPs，然后在适当的温度下进行预变性处理，使DNA双链解开。
PCR循环：
加入DNA聚合酶和荧光染料，在变性、复性、延伸的温度循环中完成DNA的扩增。
通过荧光信号的读取和分析，得出待检测DNA样品的浓度和序列信息。
结果分析：
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高分辨率等优点，能够检测出微量的DNA，并准确地检测出DNA序列的变异和突变。
结果分析方法包括定量和相对定量，根据实验需求选择合适的方法进行分析。
整个实验过程中，需要注意试剂的配制顺序、酶的使用条件、模板的添加量以及引物的浓度，以确保实验的准确性和可重复性。此外，实验设计阶段需要充分考虑实验原理、操作流程、设备和试剂的选择，以及实验记录的详细性，这些都是保证实验成功和结果可靠的关键因素。
实验流程：
1. 配制PCR反应体系：
- 模板DNA：10-100 ng（取决于模板的复杂性和丰度）
- 引物F（正向）：0.1-1.0 μM
- 引物R（反向）：0.1-1.0 μM
- dNTPs（混合的dATP、dCTP、dGTP、dTTP）：0.2 mM each
- 10×PCR缓冲液：1×
- MgCl2：1.5-2.5 mM（根据酶的要求调整）
- DNA聚合酶：0.5-2.5 U（根据酶的活性调整）
- 无菌去离子水：补足至总体积（通常为20-50 μL）
2. 设置PCR程序：
- 初始变性：95°C，3-5分钟（激活聚合酶）
- 变性：95°C，15-30秒（每个循环）
- 退火：50-65°C，15-30秒（根据引物Tm调整）
- 延伸：72°C，30-60秒/kb（根据目标片段长度调整）
- 终延伸：72°C，5-10分钟
- 保存：4°C
3. 执行PCR：
- 将配制好的反应体系放入PCR仪器中，启动程序。
4. 电泳分析：
- PCR结束后，取少量反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳，以验证扩增效果。
5. 结果判断：
- 观察电泳结果，目标条带应清晰可见，无非特异性扩增。
PCR操作流程及注意事项：
一、试剂准备阶段
试剂准备是 PCR 操作的个流程，需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。所有的 PCR 体系都应该在 - 20℃ 保存，除了 ddH2O 之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。体系配制完成之后应马上进行 PCR 反应。
二、样本制备阶段
样本制备是整个 PCR 反应中为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的性。严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。所有操作需要在生物柜内进行，操作前后生物柜需要进行紫外灯，注意生物柜中物品的排放。戴手套并勤于更换，要有「无核酸观念」 。
三、核酸扩增
在核酸扩增环节需要选择质量好的 Ep 管，装入反应体系的 EP 管上机前混匀、离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。同时严密检测 PCR 扩增仪的各项性能指标，其中对 PCR 扩增仪而言温度控制就意味着质量。
四、产物分析
常见问题：
1）无 CT 值出现：模板量不足（杂质的引入及反复冻融的情况等）
2）CT 值出现过晚（大于 38）：各种反应成分的降解或加样量的不足
3）标准曲线线性相关性不佳：加样误差、标准品出现降解等
4）阴性对照有信号：模板有基因组的污染
5）扩增效率低：反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应抑制
6）扩增曲线的异常：模板的浓度太高或荧光染料的降解
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