PCR扩增扩增曲线阶段简述

      PCR扩增过程中，每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。随着反应循环次数的不断增加，所扩增的目的基因片段呈指数规律增长，反应中产生的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正比。仪器实时检测和采集的荧光信号，随着时间和循环数的不断增加，产生一条反映实时荧光信号强度变化的曲线，称为扩增曲线。正常状态扩增曲线：正常PCR扩增曲线呈“S”型，分为基线期、指数期、线性期、平台期。扩增曲线良好的指标是曲线拐点清楚，扩增曲线整体平性好，基线平上扬现象。

1、基线期

PCR起始时，刚开始前几个循环的荧光信号还没有发生变化，接近一条直线，将其称之为基线，一般是3-15个循环。在基线期内，扩增的荧光信号被背景荧光信号所掩盖，无法判断PCR产物量的变化。

2、指数期

扩增的荧光信号高于背景荧光信号，扩增曲线起峰，开始进入指数期。在指数期内，每个循环积聚的产物准确加倍（假定100%反应效率）。该阶段的PCR反应具有高度特异性和精 确度。因为所有试剂均充足，反应的动力学推动反应有利于扩增子加倍，所以产物出现指数级扩增。只有在这个阶段，Cq值与初始模板量的对数之间存在线性关系，所以在此阶段进行定量分析合适。

3、线性期（高变异性）

随着PCR反应体系各成分的消耗，其中的一种或者多种成分限制反应，导致反应开始减缓，并且每个循环的PCR产物不再加倍，该阶段不再是指数级扩增。

4、平台期

反应停止，不再产生更多产物，并且如果放置时间够长，PCR产物将开始降解。因为每个样品具有不同的反应动力学，所以每支试管或每个反应将在不同的时间点进入平台期，zui 终的产物含量也各不相同。

由于线性期和平台期的扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的产物量与初始模板量之间没有线性关系，所以也不能通过这两个阶段的PCR产物量计算出初始模板量。想要知道初始模板量的多少，还要依赖指数期的Cq值进行计算。 

理论上，PCR每个循环后扩增产物量即增加一倍，扩增曲线应表现为荧光值随着循环数增加而不断上升。

实际上，扩增曲线的荧光值并不会随着循环数的增加而无限上升。这是由于PCR扩增进行到一定阶段，反应体系中的原料发生消耗和变性，如dNTP和酶等原料相对于模板减少，同时酶活性逐渐达到饱和；引物二聚体和反应亚产物（如焦磷酸）的产生也会抑制扩增反应；引物和已扩增的DNA片段间的竞争等都会导致PCR的扩增效率逐步降低，直至为0。因此，扩增曲线表现为扩增到一定的循环数后，荧光值不再随着循环数发生变化，而是保持平坦，出现平台期。